?论著?
HCV的清除对肝硬化患者的肠道菌群失调或系统性炎症无影响
余乐乐译；闾军审校
（BajajJS,etal.HCVeradicationdoesnotimpactgutdysbiosisorsystemicinflammationincirrhoticpatients.AlimentaryPharmacologyTherapeutics.;44(6):-）
背景：丙型肝炎病毒（HCV）的清除逐渐增加，在肝硬化患者与肠道微生态失调相关的促炎环境方面，其影响尚不清楚。肝硬化患者HCV根除率正在增加，但其对促炎环境的遗留影响尚不清楚，而这可能与肠道菌群失调有关。目的：明确HCV肝硬化患者的持续病毒学应答（SVR）对肠道菌群失调和系统性炎症反应的影响。方法：对HCV肝硬化患者获得/无SVR（获得1年以上）和年龄匹配的健康对照者进行血清和粪便采集。分析血清IL-6、TNF-α和内毒素，使用多靶焦磷酸测序分析粪便菌群。使用UNIFRCE分析和肝硬化菌群失调率（得分越低表明失调）作为评估指标，分别比较了肝硬化获得SVR组与未获得SVR组，健康对照组与肝硬化患者组微生物状态。结果：共有例HCV肝硬化患者和45例年龄匹配的健康对照者入组。其中21例患者前期使用聚乙二醇干扰素+利巴韦林治疗（中位数时间为15个月）的患者获得SVR。SVR与无SVR的肝硬化患者在人口统计学、肝硬化的严重程度、合并用药或糖尿病等方面没有显著差异。在所有的菌群组成（UniFracP=0.3）整体或在特定的微生物科（肝硬化失调率中位数为1.3vs.1，P=0.45）无显著差异。同样的结论也延伸到IL-6、TNF-α和内毒素水平。然而，与健康对照组相比，这两组都有显着的菌群失调[UNIFRACP=0.01，肝硬化失能比（1.1vs.2.9，P0.）]以及更高水平的内毒素，IL-6和TNF-α。结论：无论是否获得SVR，在HCV肝硬化患者中均可见到肠道菌群失调和炎症系统性环境。这种持续的失调可能在肝硬化患者根除HCV后有不同速率的改善。
前言
HCV是导致肝硬化发病和死亡的最常见原因之一。随着新型治疗HCV方法的出现，根除HCV对肝硬化患者自然史的影响成为一个研究的重点。之前的研究使用干扰素和利巴韦林已明确其在生存和认知方面有所改善，然而并不能完全消除肝细胞癌（HCC）或失代偿风险。实际上其它研究表明，尽管进行了抗病毒治疗，肝脏仍会出现疾病的继续发展和恶化的可能。肝硬化的进展和相关并发症的发生，与肠道菌群失调导致的系统促炎环境相关。这些潜在的疾病自然史的差异可能是由于遗留的内在肝硬化相关的促炎环境，与潜在的肝脏疾病活动或肠道微生态失调互相关联。由于患者在肝硬化的不同阶段有不同程度的肠道菌群失调，这可能会在SVR的整体影响中发挥作用，而这取决于获得SVR时的纤维化程度。
我们假设，已获得SVR的肝硬化患者与未达到SVR的患者相比，有较低的肠道微生态失调和系统性炎症反应。我们的目的是要明确长期的持续的SVR对HCV肝硬化患者肠道微生态失调和全身炎症反应的影响。
方法
从弗吉尼亚州里士满VA和VCU医疗中心肝病诊所门诊病人中招募肝硬化患者，要求为HCV作为唯一肝硬化致病原。使用下列方法诊断肝硬化：活检诊断、慢性肝病患者内镜下可见静脉曲张或具有肝硬化和门脉高压症影像学证据。我们排除了那些不同意实验条款的其它原因导致的肝硬化（明显饮酒史、肝组织活检提示非酒精性脂肪肝、乙型肝炎、胆汁淤积性疾病或自身免疫性肝病）、HCC、合并HIV感染、近3个月内使用抗生素（包括利福昔明）、益生菌和大量饮酒的患者。一直处于HCV治疗期间或12个月内停止HCV治疗的患者，被视为获得SVR不到一年时间而被排除。我们收集了患者近三天的饮食史。对HCV治疗史以及目前的HCV-RNA、HCV基因型和SVR的状况进行评价。健康对照组也使用通过社区广告和口碑纳入，同样进行相同的近期饮食分析。所有受试者均通过血液和粪便分析全身炎症和内毒素水平。样品的采集和处理使用的是Parapak粪便收集试剂盒和5mLRNALater收集新鲜粪便样品，在收集的24小时内从中提取DNA。分别采用ELISA法和LAL法评价血清TNF-α、IL-6、内毒素水平。
菌群分析
采用公开的技术从粪便中提取DNA，然后用16SrRNA的长度非均质性PCR（LH-PCR）指纹图谱快速检测样本内容物并标准化社区。然后使用多标记焦磷酸测序（MTPS）分析相关的微生物群，这种技术可以一次对多个样本进行快速测序。更多详情请参阅数据S1（略）。
统计分析
适当采用方差分析、卡方检验或Fisher精确检验比较组间人口统计学、MELD评分、失代偿、联合治疗的药物、IL-6、TNF-α和内毒素水平。对于微生物，粪便UniFrac分析是在对照组和肝硬化组之间以及肝硬化患者有/无SVR间进行。微生物生态学（qiime）使用加权值进行定量分析。Metastats和Kruskal–Wallis试验确定各组不同的细菌族。肝硬化失调率（瘤胃球菌科+毛螺旋菌+韦荣氏球菌科+梭菌目科簇十四/类杆菌科+肠杆菌）也进行了计算和比较。代偿期患者（无肝性脑病、腹水或静脉曲张出血病史）与失代偿患者相比较。此外，在无SVR组内，之前治疗失败的患者与那些从未接受过HCV治疗的患者进行比较。所有分析均采用q＜0.05。
样本大小
采用肝硬化失调率的先验分析，我们预期在获得SVR后从0.9±0.4升至1.3±0.4。假设a=0.05，检验效能为80%，我们估计每组至少需要17例观察对象。
本研究活动通过医疗中心的机构审查委员会批准。
结果
我们招募了45例健康对照者和例HCV肝硬化患者，其中21例已经获得SVR，截止登记前持续时间中位数为15（IQR12-46）个月。比较已获得SVR组和其他组，在人口统计学、肝硬化严重程度或联合治疗的药物方面没有显著差异（表1略）。只有2例患者在入组前获得SVR超过4年。获得SVR大于5年的患者由于多种原因不太容易入组，包括肝移植、肝癌的发展、获得SVR后由于持续的酒精滥用或伴随NAFLD而失去代偿能力、其他伴发的肝脏疾病、失去随访或不愿意参与这项研究。
SVR组中，采用聚乙二醇干扰素和利巴韦林联合治疗19例患者，聚乙二醇干扰素+利巴韦林+Telepravir治疗另外2例患者。其中HCV基因型1（n＝13），基因型2（n＝6）和基因型3（n＝2）。无一例患者在获得SVR后出现失代偿表现。
无SVR的84例患者中，28例患者尝试了聚乙二醇干扰素+利巴韦林治疗（13例因不良反应而过早停止，9例达到3个月，未适当减少病毒RNA水平，6例在病毒抑制后复发）。这些患者从最后一次治疗到入组的时间间隔为18±10个月，与已获得SVR患者的最后一次治疗时间，在统计学上可认为相似（P=0.31）。
在剩下的无SVR组的56例患者中，包括不愿接受治疗（n=16）、没有进行评价或三联疗法治疗（n=10）、由于伴随神经心理问题者不适用聚乙二醇干扰素+利巴韦林治疗（n=14）、血小板减少症（N=9）、贫血（n=4）和低白细胞计数（n=3）。这些患者的病毒载量中位数为90万拷贝/ml，主要是基因型1（n=71），其次是基因型3（n=6），基因型2（n=4）和基因型1和4（n=3）。
根据病历审查、个人询问和亲属证实，所有患者或受试者都没有滥用酒精。
微生物相
加权UniFrac在肝硬化患者有/无SVR组间相似（P=0.3），但在肝硬化患者组和对照组之间有统计学差异（P=0.01）。在菌群科别层面的比较（图1略），潜在致病菌（肠杆菌科）或有益的菌科（梭菌科十四、毛螺旋菌科、瘤胃球菌科）的相对丰度在肝硬化有/无SVR组间无统计学差异。通过Meta-stats和比较肝硬化菌群失调率，同样无统计学差异（P=0.45）。
然而，与对照组相比，肝硬化患者无论是否获得SVR均表现明显的菌群失调（有益菌群减少，致病菌群增多）。分别与所有肝硬化患者组和有/无SVR患者组比较，对照组肝硬化菌群失调率均更高[中位数IQR对照组2.9（4.5）与肝硬化组1.1（3.5），P0.）]肝硬化患者有/无SVR组间，促炎性细胞因子和内毒素水平无统计学差异（表1）。然而，对照组、肝硬化有/无SVR各组间相比，TNF-α水平有统计学差异（对照组5.2±4.1vs.肝硬化组10.3±11.4pg/mL,P=0.)IL-6(0.8±3.4vs.16.0±40.8pg/mL,P0.)及(0.06±0.04vs.0.2±0.28EU/mL,P=0.)（表1））。
与失代偿期患者相比，代偿患者无论是否获得SVR，均有更好的肝硬化失调率[中位数（IQR）1.4（2.7）vs.0.45（1.3），P0.]，内毒素血症发生率降低（0.12±0.3vs.0.24±0.12，P=0.04），TNF-α降低（5.7±12.6vs.11.4±8.6，P=0.05）和IL-6降低（5.5±20.7vs.35.4±58.5，P=0.）。
当我们比较未获得SVR组内的那些治疗失败的患者（n=28）和从未接受治疗的患者（n=56），可发现在肝硬化失调率[平均为1.2（2.9）vs.0.9（3.4）无差异]或UniFrac（P=0.42）没有统计学差异。
结论
我们发现，与健康对照组相比，尽管已达到长期HCV根除状态，HCV肝硬化患者仍表现肠道菌群失调，伴随持续性的全身炎症反应和内毒素血症。
值得注意的是，随着HCV治愈率的提高，病因学在整个疾病的进展过程中可能会根据病程的不同而有所不同。有新的证据表明，尽管已使用旧的疗法如聚乙二醇干扰素+利巴韦林根除HCV，肝硬化患者仍持续处于发生类似HCC和疾病进展的并发症风险中。遗留的肝硬化并发症风险可能影响临床实践，因此阐明其潜在的机制十分重要。
肝硬化患者有一种内在的促炎环境，部分受肝病病原学的影响。随之而来的肠道微生态失调可能与内毒素血症导致的全身性炎症相关。这可以使肝脏致敏，并在肠-肝轴上传播损伤。我们的研究结果表明，肝硬化是否获得SVR，肠道失调和相关的全身炎症反应以及内毒素血症水平无统计学差异。我们选取已获得SVR时间超过12个月的患者作为观察对象，以确保全身炎症环境稳定。
肝硬化患者有/无SVR出现的细菌类群反映了前期研究，患者具有较低相对丰度的内源菌群，高丰度的如肠杆菌科细菌的潜在致病类群。这种微生物分布是肝硬化自然史的典型特点，无论SVR如何，发现在失代偿期患者中更差，与健康对照中发现的特征有显着差异。此前对其他肝硬化病因的研究也表明，随着肝硬化的进展，类肝病分类群也有类似的减少。由于菌群失调和炎症随着进展性肝硬化而恶化，所以在根除HCV时达到的肝硬化阶段可能是潜在的肠道微生物群状态是更强的决定因素，而非HCV本身的。与早期肝硬化患者相比，进展期肝硬化患者随着时间的推移，HCV根除所获益处相对减少可能是背后的一个因素。
干扰素和利巴韦林在肝硬化患者中的治疗充满了耐受性、合格性和缺乏应答的问题。这些问题在我们的人群得到了充分的体现，因此SVR组代表了能够达到这一结果的肝硬化患者的人群。这些患者可能具有潜在有利的免疫遗传环境。然而，尽管SVR患者的这些因素可能会改善他们的总体预后，但是我们仍然没有发现微生物分类群或全身炎性标志物的任何变化。
由于这是一个横断面研究，所以很难预测个体患者在HCV治疗过程中的纵向变化。然而，由于SVR和非SVR组相互平衡，包括人口统计学、肝硬化严重程度、糖尿病、伴随药物和卡路里摄入量在内的最可能的混杂因素，结果似乎是有效的。尽管对照组PPI的使用低于肝硬化患者，但在肝硬化组内并无差异。这可能会加剧对照组和肝硬化患者之间的菌群失调，但是由于使用PPI后增加的链球菌科在组间差异不大，所以估计不太可能发生。获得SVR更长时间后，微生物群和炎症环境可能会发生变化，然而本研究组内患者获得SVR时间较短，尚不能得出结论。
对于已经清除病毒5年以上的患者进一步研究可能需要研究潜在的肝硬化退化的影响。这种缺乏变化也可能是由于HCV的自然病程较长以及肝脏疾病以外的原发性肠道作用缺乏导致的，而不像酒精性肝病，在酒精性肝病中即使在短期戒酒后也会出现再次增生。这些变化还需要在其他病因的情况下进行研究，例如HBV和NAFLD，这些病因往往在HCV患者中共存，然而本研究未涉及这类情况。
未来可研究将慢性乙肝病毒抑制状态视为潜在的阳性对照组，来明确是否存在的肝硬化退化或驱动肠道微生物群变化的病因学特异性过程。在我们的患者中肥胖和糖尿病的流行反映了美国肝硬化人群的特点，但可能潜在地损害肝脏愈合，并且可能与其相关。也有可能因为有/无SVR的组在临床上没有显著差异，所以对微生物群的影响相对较弱。考虑到肠道生态失调和炎症变化不足，还可以推测，与仅根除HCV疗法相比，基于消化道的治疗（例如根除HCV联合益生菌）的联合方法可能更有效地协同改善炎症。
目前的长期SVR结果只能在既往的疗法中进行研究。这些发现需要在更新的直接作用抗病毒疗法时代的背景下重新审视，现在HCV根除几乎是常态。然而，研究结果表明应该鼓励肝硬化患者，即使在HCV根除后也持续监测其指标水平。
我们的结论是，在这个横断面研究中，无论是否获得SVR，都在HCV肝硬化患者中发现肠道生物失调和系统性炎症环境。这种持续性的菌群失调可能不同程度地有助于HCV根除后肝硬化状态的改善。（本文图标略）
（本文编辑：赵春燕）
余乐乐译赞赏
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